视网膜结构精细、细胞类型多样，其发育过程及退行性病变一直是眼科研究的重要课题。人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）能够在体外分化并自组织形成视网膜类器官，模拟人视网膜发育的部分时序和空间结构，为发育研究、疾病建模和药物筛选提供人源实验模型。然而，传统方法常受到分化效率不稳定、类器官大小不一及非视网膜组织混杂等问题的限制。
2024年6月13日，印第安纳大学医学院等机构的Jade Harkin、Jason S. Meyer等研究人员在《PNAS》在线发表题为“A highly reproducible and efficient method for retinal organoid differentiation from human pluripotent stem cells”的研究论文，提出一种更高效、重复性更好的视网膜类器官标准化分化方法。
研究将单细胞定量重聚集与早期BMP信号调控结合，在所测试的6株人多能干细胞中获得了100%的视网膜类器官分化效率，同时提高形态一致性，并观察到视网膜神经节细胞和光感受器分化提前。更进一步，该体系能够在早期引导视网膜或皮质前脑命运，为解析两条发育路径的分化起点提供工具。
文章亮点
统一分化起点：将干细胞解离为单细胞，按固定数量在低黏附U底96孔板中重聚集，显著降低早期细胞团的大小与形状差异。
把握信号窗口：第6天加入BMP4，联合标准化重聚集，在实验中实现100%的视网膜类器官产出；抑制BMP信号则使培养物转向皮质前脑表型。
跨细胞系验证：在H7、H9、PGP1、IMR90-4、WTC11及新建JM2019等6株细胞中验证，包括既往视网膜分化表现较差的WTC11。
捕捉早期命运分流：比较第6天神经上皮与第8天不同处理组的转录组，识别视网膜和前脑谱系建立初期的基因变化。
加快后续分化：标准化方法使BRN3b和CRX等标志物更早表达，第150天出现更明显的光感受器节段与相关蛋白表达。
研究内容
从起始细胞团入手提高类器官一致性
传统方法常通过酶处理释放整块干细胞克隆，形成的细胞团大小取决于原始克隆的形态。起点的差异随后延续到类器官培养过程中，使不同样本之间难以直接比较。
研究团队改用Accutase将细胞解离为单细胞，再以250、500、1000、2000、4000和8000个细胞／孔接种至低黏附U底96孔板，使其快速重聚集。与传统方法相比，各接种密度组在第3天和第6天的二维面积与圆度均更加一致；H9和PGP1细胞的补充实验也支持这一结果。
图1｜定量重聚集提高早期细胞团的一致性。A、B比较传统与标准化方法；C—I展示不同起始细胞数形成的细胞团；J—O比较第3天和第6天的面积与圆度。来源：原文图1。
起始细胞数影响视网膜命运的建立
细胞团外形一致，并不意味着一定能高效形成视网膜。研究利用SIX6:GFP报告细胞系，将早期视网膜相关转录因子SIX6的表达作为谱系判定指标，进一步比较不同起始细胞数的效果。
在本文所用分化条件下，250和500个细胞／孔的组别视网膜诱导能力较低；当起始细胞数为1000至8000个／孔时，第16天观察到全部被评估细胞团均表达SIX6:GFP。综合早期形态一致性与视网膜分化效率，研究选择2000个细胞／孔作为后续实验的起始条件。
图2｜起始细胞密度影响视网膜类器官形成。A为定量重聚集示意；B为第16天SIX6:GFP阳性类器官比例；C—T为不同密度组的明场、荧光及合并图像。来源：原文图2。
定量重聚集联合BMP4实现高效诱导
研究在第6天向培养物加入50 ng/mL BMP4，或加入200 nM BMP信号抑制剂LDN-193189，比较不同起始培养方式与信号条件的组合效果。第25天，传统方法不加BMP4时，SIX6:GFP阳性类器官比例为38.67%±6.12%；加入BMP4后提高至84.33%±2.91%。标准化方法不加BMP4时为51.67%±20.93%，而联合BMP4后达到100%。上述数值为均值±标准误，相关实验包含3次生物学重复。
当BMP信号被抑制时，两种方法均未检测到SIX6:GFP表达，培养物转而表达FOXG1、CTIP2等皮质前脑相关标志物。这说明，在本文的早期神经上皮培养条件下，BMP信号是影响视网膜与前脑命运选择的关键因素。
图3｜标准化培养与BMP4的联合效应。A—L比较不同培养及信号条件下的类器官；M为SIX6:GFP阳性比例；N、O比较第25天的面积与圆度。来源：原文图3。
六株细胞验证方法的适用性
为确认高效率并非报告细胞系的特例，研究纳入2株人胚胎干细胞和4株诱导多能干细胞，涵盖不同供体来源及既往分化表现。其中WTC11曾被观察到视网膜分化能力较差，JM2019则是研究新建立的细胞系。
第25天，研究以视网膜祖细胞标志物VSX2进行免疫染色。传统方法的阳性类器官比例随细胞系而变化，WTC11约为30%，H7和H9超过80%；采用标准化方法后，6株细胞均获得100%的VSX2阳性类器官比例，每株细胞对应3次生物学重复。
图4｜不同人多能干细胞系中的分化效率比较。A—F为传统方法，G—L为标准化方法；绿色为VSX2，蓝色为DAPI；M—R为各细胞系的分化效率定量。来源：原文图4。
转录组捕捉视网膜与前脑命运分流
研究将第6天、尚未接受BMP调控的早期神经上皮细胞团作为基线，与第6至8天接受BMP4或LDN-193189处理的培养物进行mRNA测序比较，并将平行培养物保留至第25天验证最终谱系。
仅经过2天BMP4处理，SIX6、RAX、LHX9、VSX2和PAX6等视网膜发育相关基因即出现上调，并伴随BMP响应和细胞外基质相关转录特征变化。LDN处理组则上调FOXG1、NEUROD1、MAP2等基因，呈现更明显的前脑与神经元分化相关特征。
SIX6转录本在第8天已表现出差异，而SIX6:GFP报告信号接近第10天才明显出现。这提示，转录变化可以早于可见报告信号，检测时间点应与具体读出相匹配。
图5｜早期命运决定的转录组分析。A为取样与后续谱系验证流程；B、C比较第8天BMP4组与第6天基线；D、E比较LDN组与基线；F、G比较第8天BMP4组与LDN组。来源：原文图5。
神经节细胞与光感受器分化提前
长期培养显示，标准化方法的优势延续至后续视网膜神经元形成。第30天，BRN3b报告信号及相关表达更明显，提示视网膜神经节细胞分化提前；至第80天，传统方法的BRN3b表达逐渐追上。
光感受器方面，标准化组在第50天之前已出现CRX表达启动，而传统组约在第60天出现；第60天，标准化组类器官顶端可见更丰富的CRX阳性细胞。至第90天，两组CRX和OTX2表达不再有显著差异，支持早期分化加快，而非所有阶段始终保持相同幅度的优势。
第150天，标准化组中全部被评估类器官形成完整的光感受器节段刷状边缘；传统组完整和部分刷状边缘的比例分别为6.00%±3.79%和26.33%±15.30%。标准化组还出现更明显的NRL、ARR3及Rhodopsin表达。
图6｜标准化方法促进后续视网膜细胞分化。A—G展示第30天神经节细胞相关结果；H—N展示光感受器前体及CRX表达；O—X展示第150天节段形态和光感受器标志物。来源：原文图6。
视网膜类器官的构建方法
01 | 起始细胞与定量重聚集
选择状态良好、约70%汇合的hPSC培养物，以Accutase解离为单细胞。将细胞接种至低黏附U底96孔板，后续实验采用2000个细胞／孔；每孔起始加入100 μL mTeSR1或mTeSR PLUS培养基，并补充20 μM ROCK抑制剂Y-27632，以支持单细胞处理后的存活及重聚集。
02 | 第0至3天逐步转入神经诱导
接种后的次日定义为第0天，在第0天每孔加入50 μL干细胞维持培养基与50 μL神经诱导培养基（NIM），添加液含20 μM Y-27632。第1天，用剪口移液吸头将细胞团转至10 cm培养皿；补充方法采用每皿约40—45个，以减少融合。换入6 mL维持培养基与6 mL NIM的混合培养液。
第2天移去6 mL培养液并补入6 mL新鲜NIM；第3天转入12 mL完整NIM。NIM由DMEM/F12、1% N2、1%非必需氨基酸、1%抗生素抗真菌剂及2 μg/mL肝素组成。早期转移应尽量维持完整、大小一致的细胞团。
03 | 第6至15天诱导视网膜命运并短期贴壁
第6天，全部换为含50 ng/mL BMP4的新鲜NIM，启动视网膜定向诱导。200 nM LDN-193189用于论文中的BMP抑制和前脑命运对照，不属于常规视网膜构建组的添加物。
第8天，将细胞团重力沉降收集。每个6孔板孔先加入500 μL胎牛血清（FBS），再加入含20—30个细胞团的2 mL原NIM培养液，轻轻分散以促进均匀贴壁。第9天换掉一半旧液，补入等体积、不含FBS的新鲜NIM，使FBS降至10%；第12、15天继续半量更换新鲜NIM。
04 | 第16至22天恢复三维悬浮培养
第16天，用P200吸头轻柔剥离贴壁类器官，转入10 cm培养皿，以含1% FBS的视网膜分化培养基（RDM）悬浮培养。RDM使用DMEM与F12按3∶1配比，补充2% B27、1%非必需氨基酸和1×抗生素抗真菌剂。
第18天和第20天换液时，将FBS依次提高至3%和5%；第22天转入进阶视网膜分化培养基（ARDM）。补充材料列出的ARDM包含DMEM/F12、2% B27、1%非必需氨基酸、1×抗生素抗真菌剂、1×GlutaMAX、10% FBS及牛磺酸，此后每2—3天换液，并新鲜加入GlutaMAX、FBS和牛磺酸。
05 | 第50天起支持后期光感受器分化
第50天起，在长期培养体系中加入1 μM全反式视黄酸、20 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）及50 μM二十二碳六烯酸（DHA）。第90天移除视黄酸，BDNF与DHA按补充方法维持至实验终点。论文将培养观察延长至第150天，以评价光感受器节段和相关蛋白表达。
06 | 分阶段确认构建质量
早期关注细胞团数量、大小、圆度及是否融合；第16至25天结合SIX6报告信号或VSX2免疫染色评估视网膜谱系，必要时检查FOXG1、SOX1等非目标谱系标志物。第30天以后关注BRN3b，第50至60天关注CRX及其空间分布；第150天结合NRL、ARR3、Rhodopsin与节段形态评价后期分化。
总结
这项研究通过定量重聚集和第6天BMP信号调控，将视网膜类器官构建中的两个关键变量——起始细胞团状态与早期谱系诱导——连接起来，在所测试的6株细胞中实现了高效率且形态更一致的视网膜类器官分化。
其价值既在于提高产出，也在于提供更清晰的发育研究窗口：第6至8天即可捕捉视网膜与前脑命运分流的转录变化，后续还可观察神经节细胞和光感受器分化提前。这为减少疾病建模与药物筛选中的培养差异提供了方法学基础。
未来仍需在更多患者来源细胞、跨实验室重复性和功能检测中验证该方法。更早出现成熟相关标志物，并不等于已经构建完整、功能等同于成人组织的视网膜。
参考文献