引言
人类胚胎发育过程中，心血管系统和造血系统在解剖学上密切相关，共同起源于中胚层前体细胞。在人类发育的第三周，双侧心脏形成区在中线融合形成跳动的心管；随后，双侧背主动脉也融合形成背主动脉，通过流出道与心管相连。到第四周，确定性造血发生在背主动脉腔内，而原始造血已经在支持胚胎发育。
为了在体外重现这一发育窗口期，德国汉诺威医学院的研究团队近期发表了题为《Production of human blood-generating heart-forming organoids and sample preparation for advanced imaging》的研究，构建了血液生成心脏类器官（Blood-Generating Heart-Forming Organoids, BG-HFOs）。该模型是在心脏类器官（HFOs）基础上的进一步优化，能够同时诱导造血系统的发育。BG-HFOs由三层结构组成：内核（inner core，IC）、心肌层（myocardial layer，ML）和外层（outer layer，OL）。其中，外层包含能够产生造血祖细胞的造血内皮，这些祖细胞可进一步分化为巨核细胞/红系和髓系谱系，并显示出淋巴潜能，表明该模型中同时存在原始和确定性造血波。
本文详细介绍了从人多能干细胞（hPS细胞）生成BG-HFOs的14天培养方案，以及用于高级成像的样品制备方法。
图1 BG-HFO与HFO的比较示意图。
展示了BG-HFO和HFO的前视图和侧视图。两种类器官模型均具有由心肌细胞（CMs）构成的心肌层（ML），内核（IC）中的内皮细胞（ECs），以及外层（OL）中的心肌细胞和原心外膜/横隔间充质样细胞（PE/ST），最外侧还包含间充质（MES）。在HFO中，内核还包含前肠内胚层（AFE），并被一层心内膜样细胞（ELCs）包围，外层还包含后前肠内胚层（PFE）。而在BG-HFO中，这些组织被特化的内皮结构所取代，包括造血内皮（HE）和造血细胞（HCs），主要位于外层。
研究设计
一、细胞系选择
本方案推荐使用以下细胞系：
HES3 NKX2.5-eGFP：心肌细胞报告基因系，可从第7天开始观察心肌层的形成
HES3 MIXL1-GFP：中内胚层报告基因系，可在第2-4天观察中内胚层的形成模式
其他hPS细胞系也可使用，但可能需要优化接种密度（3000-10000个细胞/孔）和CHIR浓度（5-10μM）
二、实验对照设置
如使用患者来源的hiPS细胞系研究疾病，需包含同基因对照
药物测试实验需设置未处理对照组和溶剂对照组
建议生成比理论需要更多的样本，以应对生物学变异
三、评估分化成功的方法
成功的BG-HFOs应显示典型的IC/ML/OL分层结构：
如使用患者来源的hiPS细胞系研究疾病，需包含同基因对照
药物测试实验需设置未处理对照组和溶剂对照组
建议生成比理论需要更多的样本，以应对生物学变异
四、预期结果
形成效率
hES细胞系的BG-HFO形成效率为70-80%
hiPS细胞系的形成效率约为35%
成功形成的BG-HFOs直径可达2-4毫米
五、细胞组成（流式细胞术分析）
12-20% NKX2.5阳性和cTnT阳性心肌细胞
20-25% CD31阳性和CD144阳性内皮细胞
7-10% CD34阳性造血内皮细胞
10-20% CD43阳性造血细胞
4-6% CD45阳性造血细胞
六、组织定位（免疫荧光染色）
内核：CD31/CD144阳性内皮细胞、波形蛋白阳性间充质细胞
心肌层：NKX2.5阳性心肌细胞
外层：NKX2.5阳性心肌细胞、CD31/CD144阳性内皮细胞、CD45阳性造血细胞、造血内皮
图2 BG-HFO 的结构和细胞组成
a. BG-HFO的组织构成示意图。b、c. 通过全组织免疫荧光染色和基于MSBB的透明化处理后获得的共聚焦显微镜图像，重点显示了BG-HFO中的浦肯野细胞（b）或内皮细胞/微血管层（c），以定位NKX2.5阳性心肌细胞、CD31阳性和CD144 阳性内皮细胞、CD45 阳性造血细胞以及单阳性于波形蛋白的细胞（指示MES）。d. 四到五个匀浆后的BG-HFO的代表性流式细胞图，显示 NKX2.5-eGFP阳性和cTnT阳性心肌细胞、CD31阳性和CD144阳性内皮细胞、CD34阳性血窦内皮细胞以及CD43阳性和CD45阳性造血细胞。FSC-A 为前向散射面积；FSC-H 为前向散射高度；SSC-A 为侧向散射面积。
实验步骤
1
第一阶段：hPS细胞培养（第-4天前）
1、细胞复苏与传代
在37°C水浴中快速解冻hPS细胞
300g离心3分钟
接种于Geltrex包被的T25培养瓶
E8培养基+10 μM Y27632培养
每2天换液，达到90-100%汇合度后传代
2
第二阶段：BG-HFO生成（第-4天至第10天）
2、第-4天：细胞接种形成聚集体
消化收集hPS细胞
每孔接种5,000个细胞于96孔U型超低吸附板
E8培养基+10M Y27632
300g离心6分钟，37°C培养过夜
3、第-2天：Matrigel包埋
每个聚集体包埋于20 LMMatrigel液滴中
37°C孵育1小时凝固
加入E8培养基+BMP4（10 ng/ml）
4、第0-1天：WNT通路激活
第0天：RB-培养基+CHIR（7.5 μM）+BMP4+bFGF，处理24小时
第1天：更换为RB-培养基+VEGF+bFGF
5、第3-5天：WNT通路抑制及造血诱导
第3天：RB-培养基+IWP2（5 μM）+造血因子鸡尾酒（VEGF、bFGF、SCF、EPO、IL-6、IL-11、IGF-1）
第5天：移除IWP2，继续添加造血因子并补充TPO、FLT-3、IL-3、BMP4、SHH
6、第7-10天：成熟培养
第7天起使用RB+培养基（含胰岛素）
继续添加完整的造血因子
第10天完成分化
3
第三阶段：免疫荧光染色与组织透明化
7、whole-mount IF staining（30小时）
4%多聚甲醛固定1小时
封闭缓冲液处理1小时
一抗孵育20小时
二抗+DAPI孵育4小时
8、组织透明化方法
MSBB法(54小时，猝灭转基因信号)：梯度乙醇脱水、MSBB透明化处理
PEGASOS法（58小时，保留转基因信号）：梯度脱脂溶液处理、tert-丁醇-PEG处理、BB-PEG最终透明化
常见问题及解决方案
一、聚集体形成异常
问题：形状不规则或每孔多个聚集体
解决：检查离心设置；确保使用新鲜的超低吸附板
二、分化失败
问题：无法形成IC/ML/OL分层结构
解决：1.验证hPS细胞质量（多能性、核型）
2.优化CHIR浓度和处理时间
3.确保所有生长因子正确配制和储存
三、造血细胞缺失
问题：心脏分化正常但无造血细胞
解决：1.检查造血因子的配制
2.确认添加时间点正确
3.避免反复冻融
四、Matrigel液滴损坏
问题：换液时聚集体被吸走
解决：缓慢吸液，特别是接近Matrigel时；每两周更新Matrigel
五、染色信号弱或不均匀
问题：中心区域无信号
解决：1.延长抗体孵育时间
2.优化抗体浓度
3.使用长波长荧光素标记的二抗
结语
BG-HFOs为研究人类心血管和造血系统的共同发育提供了独特的体外模型。该系统不仅能重现原始和确定性造血波，还保留了解剖学相关的心脏和血管组织。通过96孔板的标准化培养方案，该模型可用于发育生物学研究、疾病建模、药物筛选和安全性评价等多个领域。配合优化的免疫荧光染色和组织透明化技术，研究人员可以深入分析这些复杂类器官的三维结构和细胞组成，为心血管和血液疾病的研究开辟新的途径。
参考文献