皮肤不仅是人体抵御外界刺激的第一道屏障，还承担体温调节、感觉传递等重要功能。毛囊、皮脂腺和感觉神经等附属结构共同决定了皮肤的完整性，但传统二维培养和常见皮肤等效模型往往难以同时重建这些复杂成分。
波士顿儿童医院与哈佛医学院团队在《Nature Protocols》发表了一套详细方案：以人多能干细胞（hPSC，包括iPSC和ESC）为单一起始细胞群，在三维培养中协同诱导表面外胚层和颅神经嵴来源间充质，逐步形成表皮与真皮。约培养60天可出现毛囊发生，约130天形成含色素毛囊、皮脂腺、Merkel细胞和感觉神经的高复杂度皮肤类器官。
一、模型亮点
与依赖原代角质形成细胞和成纤维细胞重组的模型相比，该体系的核心价值在于“从同一批多能干细胞出发，让皮肤组织在体外自行组织”。
单一起始细胞来源：无需预先分别制备表皮和真皮细胞，hPSC在同一类器官单元中产生表面外胚层与间充质谱系。
皮肤附属结构更丰富：成熟类器官可形成分层表皮、真皮、毛囊、皮脂腺、黑色素细胞、Merkel细胞、感觉神经及Schwann细胞等。
发育时序具有参考价值：毛囊从毛基板、毛芽到毛钉和较成熟毛囊的变化，与人胎儿皮肤发育阶段具有较好的时间对应关系。
培养窗口较长：方案支持培养至约150天，为发育研究、疾病建模、单细胞测序和移植研究提供较长观察窗口。
二、研究设计
该方法的关键并不是单纯“把细胞养久”，而是在早期精确调节TGF-β、BMP与FGF信号，使表皮和真皮前体同步出现；随后把静态培养转换为摇床悬浮培养，促进组织长期自组装与成熟。
整体时间轴
Day -2至Day -1：将hPSC解离为单细胞，在96孔U底板中形成大小均一的细胞聚集体；逐步稀释ROCK抑制剂以支持存活与聚集。
Day 0：使用E6SFB培养体系启动分化：TGF-β通路抑制配合BMP4，诱导表面外胚层，并为间充质谱系共同发育建立条件。
Day 3：加入BMP抑制剂LDN-193189与bFGF，进一步调节外胚层与颅神经嵴相关谱系。
Day 6至Day 9：补充营养并进行半量换液；此时聚集体外层逐渐出现透明上皮，内部及外周出现迁移细胞。
Day 12及以后：转入OMM培养基和摇床悬浮培养，持续半量换液，等待皮肤分层、毛囊发生和附属结构成熟。
图1｜分化流程与代表性形态检查点
三、实验步骤
1
hPSC预培养与细胞聚集（Day -2至-1）
将状态良好、无明显分化的hPSC解离为单细胞，计数活细胞后按约3,500 cells/100 μL/孔接种至96孔U底板。Day -2培养基含ROCK抑制剂以降低单细胞凋亡；Day -1补加E8培养基，逐步稀释抑制剂。
2
启动皮肤谱系诱导（Day 0）
洗去维持培养基后，将每个聚集体转入E6SFB。标准方案采用2% Matrigel、10 μM SB431542和5 ng/mL BMP4。BMP4剂量需根据细胞系预实验优化，不能机械照搬。
3
LDN/bFGF处理（Day 3）
向体系加入LDN-193189和bFGF。标准E6LF条件为1 μM LDN与250 ng/mL bFGF；部分细胞系可能需要将处理时间调整至Day 4或Day 5。
4
营养补充与早期质控（Day 6至9）
Day 6补加E6培养基，Day 9进行半量换液。Day 8左右应观察到透明上皮囊样结构，外周逐步出现间充质细胞；若聚集体完全不透明或上皮过厚，应回查BMP4剂量与处理时机。
5
转入长期悬浮培养（Day 12）
清洗聚集体并转入OMM1%M培养基，随后置于约65 rpm轨道摇床。持续运动可提高含毛类器官形成的一致性；Day 15、Day 18及之后按方案进行半量换液并逐步过渡至OMM。
6
长期成熟（Day 30至150）
约Day 30出现分层表皮；Day 55-75可见毛基板、毛芽和毛钉；Day 70-130毛囊继续延长并成熟。建议在Day 150前完成下游实验，因为更晚期可能出现角化细胞堆积和毛囊融合等异常。
四、关键质控与预期结果
Day 3：表面外胚层是否建立
理想聚集体呈透明上皮包绕的球形结构；可结合TFAP2A与ECAD免疫标记确认。
Day 8：上皮囊形成
应出现透明上皮囊，暗色核心向上皮可见放射状迁移轨迹，最外层逐渐被间充质细胞覆盖。
Day 12-21：头尾极性
间充质细胞常向一侧集中，形成“尾部”间充质极与“头部”囊性极。
Day 55-75：毛囊启动
低倍倒置显微镜下应能识别毛基板、毛芽和毛钉；这是判断含毛表型是否成功的关键窗口。
Day 110-130：复杂皮肤组织
可见较成熟、部分带色素的毛囊，并伴随皮脂腺、Merkel细胞、感觉神经以及多层表皮。
图2｜不同时间点的分化检查与类器官表征：表皮分层、毛囊发生、色素及神经相关结构
五、应用前景与模型局限
潜在应用
人皮肤与毛囊发育研究：可跟踪表皮、真皮、毛囊及神经支配的早期发育过程，并与人胎儿皮肤图谱进行单细胞层面的比较。
疾病建模与药物研究：结合患者来源iPSC或基因编辑，可用于探索遗传性皮肤病、毛囊发育异常及药物反应。
再生与移植研究：研究团队已展示类器官在免疫缺陷小鼠上的异种移植潜力，为皮肤重建研究提供了实验基础。
需要正视的局限
结构与方向性：类器官呈囊状，毛干多向腔内生长；核心易积聚角化组织，晚期可出现毛干卷曲或融合。
细胞组成仍不完整：当前模型缺少汗腺、血管、免疫细胞，立毛肌也较少见；所形成毛发更接近胎儿毳毛，而非成人终毛。
存在脱靶谱系：颅神经嵴相关诱导可伴随数量不一的软骨细胞和肌细胞，需要通过早期信号优化降低批次差异。
实验周期长且依赖经验：从起始诱导到成熟表型需约4-5个月，对hPSC质量、试剂批次、聚集体一致性和形态质控均有较高要求。
六、总结
这套人多能干细胞来源的皮肤类器官方案，将“表皮—真皮互作—毛囊发生—附属结构成熟”整合进一个可持续培养的三维体系。它最有价值的地方，并非简单地在培养皿里长出毛发，而是提供了一个能够观察人皮肤复杂组织如何协同发育的实验窗口。
同时，它仍是一个偏胎儿期、囊状且缺少血管和免疫成分的模型。未来若能结合血管化、免疫共培养、气液界面或平面化培养，有望进一步提升其成熟度和转化价值。
参考文献