肺的远端区域承担气体交换，也是多种间质性肺病和呼吸道病毒损伤的关键发生部位。然而，传统2D培养难以同时呈现肺上皮分化、上皮-间充质互作以及分支形态发生。
哥伦比亚大学与西奈山伊坎医学院团队在《Nature Protocols》中系统整理了一套人多能干细胞（hPSC，包括iPSC）定向分化方案：依次经历确定性内胚层、前肠前部内胚层、腹侧化、肺芽类器官和Matrigel三维培养，约40天获得具有分支形态的远端肺类器官，并可维持超过180天。该模型可用于研究人肺发育、间质性肺病以及呼吸道病毒感染。
一、模型亮点
与常见的肺类器官体系相比，这套方案有几个值得关注的特点：
发育路径完整：从hPSC出发，连续模拟确定性内胚层、前肠前部内胚层、肺芽及远端肺组织的形成过程。
自发分支生长：肺芽类器官包埋于Matrigel后发生向外出芽和分支，形态上接近肺的分支形态发生。
上皮与间充质共存：体系中可检测到肺上皮和肺间充质相关细胞，适合研究上皮-间充质互作及纤维化。
无需谱系报告系统：常规流程不依赖NKX2.1等报告细胞系，也不需要中间纯化；但确定性内胚层纯度必须严格质控。
长期培养与多场景应用：类器官可培养超过6个月，用于发育研究、遗传性间质性肺病建模和病毒感染研究。
二、研究设计
该方案遵循胚胎肺发育的信号逻辑，以“分阶段定向诱导 + 悬浮肺芽形成 + 3D基质分支培养”为主线。约在第20-25天选择状态良好的肺芽类器官进行Matrigel包埋，随后持续培养和成熟。
1、胚样体与原条诱导（Day 0-1）
将hPSC从饲养层体系短暂转移至Matrigel以去除残余MEF，再在超低吸附板中形成胚样体；Y-27632、BMP4等信号支持原条样状态建立。
2、确定性内胚层诱导（Day 1-4）
在低氧条件下以高浓度Activin A为核心推进内胚层命运。继续分化前，应以EPCAM、cKIT和CXCR4检测确定性内胚层纯度，要求三者高表达细胞比例超过90%。
3、前肠前部内胚层诱导（Day 5-6）
将细胞接种于纤连蛋白包被板，先后抑制TGF-β、BMP与WNT信号（SB431542、NOGGIN、IWP2），建立前肠前部内胚层。
4、腹侧化与肺芽类器官形成（Day 6-20/25）
加入CHIR99021、FGF10、FGF7、BMP4和视黄酸；第8天将细胞团转入超低吸附板，逐步形成含折叠上皮片层与间充质的肺芽类器官（LBO）。
5、3D包埋与分支成熟（Day 20/25以后）
选择具有折叠上皮、中心清亮且不过度致密的LBO包埋于Matrigel。约1周出现出芽，2-3周可观察到明显分支；培养可延长至150天以上。
图1 | hPSC定向分化为远端肺类器官的时间轴与代表性形态
▪整体路径：hPSC依次经过胚样体、确定性内胚层、前肠前部内胚层、肺芽类器官和分支类器官五个关键阶段。
▪早期定向：Day 0-6通过Activin A以及WNT、BMP、TGF-β等通路的阶段性调控建立肺前体基础。
▪肺芽形成：Day 6-25以CHIR99021、FGF10、FGF7、BMP4和视黄酸维持腹侧化及肺谱系分化。
▪分支培养：Day 20-25后包埋于Matrigel，在相同核心因子支持下继续出芽、分支和成熟。
三、实验步骤
1
去除MEF并准备hPSC（Day -1）
选用状态良好、未见自发分化的hPSC。将约90%-95%汇合的细胞以Accutase消化，短暂接种到Matrigel包被皿中培养18-24小时，以减少残余MEF。
2
形成胚样体（Day 0）
用冷Trypsin/EDTA快速处理细胞，温和吹打后转入EB/PS培养基，并分装到6孔超低吸附板。低氧培养12-16小时形成大小较均一的胚样体，避免剧烈吹打和大团聚集。
3
诱导确定性内胚层（Day 1-4）
收集胚样体后更换确定性内胚层诱导培养基，并在Day 2和Day 3补充新鲜培养基。该阶段对Activin A、N2/B27以及细胞状态非常敏感，关键试剂应进行批次验证。
4
设置质量闸门（Day 4.1-4.3）
取少量胚样体消化为单细胞，检测EPCAM、cKIT和CXCR4。只有确定性内胚层纯度超过90%时才进入下一阶段；不同iPSC系可能需要在74.5-79.5小时范围内微调检测时间。
5
前肠前部化（Day 5-6）
将细胞以约7.5×10⁵ cells/孔接种至纤连蛋白包被的6孔板，使用Anteriorization medium-1培养24小时，再更换medium-2继续24小时。此后转为常氧培养。
6
形成LBO（Day 6-20/25）
Day 6开始腹侧化；Day 8更换新鲜培养基并轻柔吹悬细胞团，转至超低吸附板。Day 10起隔日换液，显微镜下持续观察折叠上皮结构和中心透明度。
7
Matrigel包埋与长期培养（Day 20/25以后）
每个24孔插入式培养皿放置1-4个优选LBO。操作全程保持Matrigel低温，采用底层50 μl、类器官混胶约30-50 μl、顶层50 μl的夹心包埋方式；凝固后加入培养基，每2-3天换液。
图2 | Day 20肺芽类器官的形态选择
上排为不建议优先挑选的LBO：中心过度致密或出现明显空腔；下排为较理想的LBO，可见折叠的上皮结构、轮廓相对清晰且中心较透明。形态学筛选虽然不是绝对标准，但能显著降低后续分支失败的概率。
四、常见问题及解决方案
该体系周期长、阶段多，早期偏差会在后期被放大。原文重点提示以下风险：
问题一：确定性内胚层纯度低于90%？
原因分析：hPSC状态或接种密度不佳；MEF、N2/B27或Activin A批次不适用；消化和吹打过度也会影响CXCR4检测。
解决方案：确认OCT4、SOX2等多能性状态；针对不同iPSC系优化接种密度和诱导时长；对关键试剂做批次测试，并减少不必要的机械剪切。
问题二：Day 8-15肺芽类器官数量少、形态异常？
原因分析：前序内胚层不合格，或前肠前部化阶段接种密度偏离最佳范围。
解决方案：原文以7.5×10⁵ cells/孔作为参考起点。密度过低时常见更少、更小且较快空腔化的类器官；密度过高时Day 8形态不明显，应按细胞系重新优化。
问题三：LBO在悬浮培养中变成空心球或破裂？
原因分析：悬浮培养时间过长，错过了适合Matrigel包埋的窗口。
解决方案：Day 20-25每日观察并及时包埋。优先选择含折叠上皮、中心清亮、无明显囊腔的LBO，避免长期悬浮至空腔化和破裂。
问题四：Matrigel中出芽或分支效率低？
原因分析：上游分化质量不佳、挑选了过度致密或囊性LBO、Matrigel提前聚合，或每个insert放入类器官过多导致营养耗竭。
解决方案：逐级回溯DE与LBO质量；Matrigel全程置冰、一次处理一个insert；每个insert控制1-4个LBO，并根据生长速度及时补充或更换培养基。
图3 | LBO形成的典型故障：接种密度偏差与悬浮培养过久
上图对比不同起始密度在Day 8的形态；下图显示LBO在悬浮培养超过适宜窗口后出现空腔化、破裂并形成无法有效分支的小细胞团。该图提示：密度控制和Day 20-25包埋时机是两个关键过程参数。
五、模型鉴定
肺类器官的鉴定不能只看“长出分支”。原文建议结合连续阶段的形态、免疫荧光以及转录组结果，判断肺谱系建立、远端肺成熟和非肺内胚层命运的逐步退出。
鉴定策略一：连续阶段的免疫荧光
【鉴定方法】
在Day 8、Day 20及Day 40-60等时间点进行切片或整体免疫荧光，联合检测EPCAM、NKX2.1、SOX2、FOXA1、ZEB1、Ki67和cCASP3等标志物，观察上皮、间充质、增殖和凋亡的空间分布。
【预期结果与科学解释】
Day 8：以前肠前部相关SOX2阳性上皮岛为主，可夹杂少量CDX2阳性细胞，并可见ZEB1阳性间充质。
Day 20：LBO由折叠和内陷的EPCAM阳性上皮构成，大范围上皮表达NKX2.1，周围仍可见间充质。
Day 40-60：类器官外周的EPCAM与NKX2.1表达更广泛；增殖细胞主要集中于外周，中心可出现非NKX2.1的FOXA1阳性内胚层样小管和较多凋亡细胞。
图4 | 不同分化阶段肺类器官的免疫荧光表征
(a) Day 8前肠前部化阶段的SOX2/CDX2及FOXA1/ZEB1分布；(b) Day 20 LBO中EPCAM、NKX2.1与ZEB1的空间关系；(c-e) Day 60类器官外周肺谱系、中心内胚层样结构、增殖与凋亡分布。这些结果共同显示：肺谱系随培养推进逐步占据类器官外周，而部分早期内胚层和间充质特征逐渐减少。
鉴定策略二：远端肺成熟度与应用边界
【成熟度判断】
建议联合检测ABCA3、SFTPB、NAPSA、SLC34A2等AT2相关标志物，并结合超微结构或表面活性物质摄取/释放功能。多数AT2相关标志物在Day 80前后逐步增强；SFTPC出现较晚，至Day 170仍并非所有细胞均表达。
【模型适用范围】
疾病建模：体系含间充质，可重现特定Hermansky-Pudlak综合征基因型相关的肺纤维化表型，并曾用于发现IL-11等潜在干预靶点。
病毒研究：类器官可用于呼吸道合胞病毒、副流感病毒和麻疹病毒感染研究，呈现与人肺感染相符的细胞学反应。
发育研究：Day 25、40、60和80的单细胞转录组显示，远端肺标志逐渐增强，其他内胚层及间充质标志总体减少。
重要局限：长期培养后的整体成熟度仍接近人胎儿第二孕期；分支缺乏体内方向性；体外难以获得成熟AT1细胞；Matrigel及酶终止步骤中血清的使用限制了转化应用。
六、结语
这套远端肺类器官方案的价值，不在于把iPSC简单培养成一个“肺样细胞球”，而在于用一条可追踪、可质控的发育路线，把早期内胚层指定、肺芽形成、上皮-间充质互作和分支成熟串联起来。
它为人类远端肺发育、遗传性间质性肺病和呼吸道病毒感染提供了较为综合的体外模型；同时，超过90%的确定性内胚层纯度、Day 20-25的LBO选择窗口以及Matrigel操作，是决定重复性的关键节点。
需要强调的是，该体系仍属于胎儿样模型，不能等同于成熟成人肺。未来若能引入更可控的合成基质、血管与免疫成分，并进一步推动AT1/AT2成熟，将更有利于机制研究和药物评价。
参考文献