胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）最棘手的生物学特征之一，是肿瘤细胞并不局限于影像学可见的肿瘤主体，而会沿脑实质弥漫浸润，并通过细长的肿瘤微管（tumor microtubes，TMs）形成相互连接、具有治疗抵抗特征的细胞网络。手术能够切除肿瘤核心，却难以清除远端浸润细胞，这构成GBM复发的重要基础。
然而，传统二维培养无法重现三维肿瘤网络和脑组织微环境；肿瘤球体缺少宿主脑组织；小鼠模型存在物种差异；脑类器官共培养虽然提供了三维背景，但其组织成熟度通常更接近胎儿脑。如何在全人源体系中同时保存肿瘤核心、浸润轨迹、细胞状态异质性与成人脑微环境，仍是GBM模型研究中的关键难题。
德国波恩大学医院等多机构团队在《Nature Protocols》发表Core2Edge方法学论文：将患者来源胶质母细胞瘤类器官（glioblastoma organoids，GBOs）植入成人来源的人器官型脑片，并结合组织扩增、光片荧光显微成像、空间转录组和多重蛋白成像，建立从肿瘤核心一直延伸至单细胞分散区的全人源ex vivo模型。
一、模型亮点
与常见的GBM体外模型相比，Core2Edge有以下几个值得关注的特点：
全人源组织组合：患者来源GBO保留肿瘤的三维结构与转录异质性，人器官型脑片则提供成人来源的灰质、白质及多类脑驻留细胞。
覆盖完整浸润轴：可区分肿瘤核心、近端浸润区（near infiltration zone，NIZ）和远端浸润区（far infiltration zone，FIZ），并追踪至单细胞分散。
保留网络形态：组织扩增结合光片荧光显微镜（LSFEM）可在完整样本尺度上重建TMs连接的三维肿瘤网络。
兼容空间多组学：固定石蜡包埋样本可用于Xenium空间转录组和CODEX多重蛋白成像，比较不同浸润区域的肿瘤状态及微环境。
可设置治疗窗口：植入后24小时的首次换液起可加入药物，并结合形态、LDH、组织学和空间读出评估区域性反应；但原文尚未完成系统性药效或临床药敏预测验证。
二、研究设计
该方案以“人脑片制备 + GBO选择与标记 + 白质区植入 + 短期共培养 + 多尺度终点分析”为主线。GBO需在脑片制备前建立稳定培养；植入后模型最多培养约10天，再根据研究目标进入组织学、空间组学或LSFEM流程。
01 人器官型脑片制备(Day0)
脑组织通常来自癫痫手术或神经肿瘤切除，取材后尽快交接并使用振动切片机制备脑片。新鲜组织的完整性、切除过程中的热损伤以及处理延迟，都会直接影响后续培养质量。
02 GBO筛选与荧光标记(Day1)
选择直径400-900 μm、外形圆整、颜色较浅且无明显坏死的GBO。常规模型使用CellBrite绿色胞质膜染料预标记，以便在脑片中识别和操作；如用于LSFEM，则需提前完成ZsGreen稳定标记和重新聚集培养。
03 GBO入人脑片(Day1)
在荧光体视显微镜下确定植入位点，优先选择白质或灰白质交界区域。使用微钩形成浅切口，以微铲将单个GBO推入切口，随后让组织自然回弹并包裹植入物。
04 共培养与处理(Days1-11)
植入后先静置恢复，24小时后首次换液；此后每48小时换液，培养总时长不超过10天。药物可从首次换液阶段加入，培养上清可用于LDH细胞毒性检测。
05 固定与下游分析(Days 3-11)
根据实验目的进行甲醛固定、石蜡包埋或速冻。下游可选择常规组织学与免疫染色、Xenium空间转录组、CODEX空间蛋白成像、单细胞测序或LSFEM三维成像。
图1 | Core2Edge的整体实验流程：人脑片制备、细胞注射或GBO植入、共培养与处理、固定，以及LSFEM和空间组学等下游分析。
整体时间：在GBO已准备好的前提下，脑片制备、植入、培养和固定约需7-12天。
前置时间：患者来源GBO的建立通常需要4-6周；若进行LSFEM，GBO转导、重新聚集及样本扩增成像还会额外增加数周。
关键窗口：模型培养不宜超过约10-12天，因为脑片活力及免疫、血管成分会随时间逐步下降。
三、实验步骤
1
制备并初步质控人脑片（Day 0）
脑组织应在切除后尽快送达实验室，原文建议2小时内开始处理。切片前去除多余液体并将组织块稳固粘接于振动切片机托盘；切片后排除碎裂、坏死、明显水肿或带有手术损伤孔洞的区域。
2
筛选并染色GB0 (Day1，约1.5小时)
在解剖显微镜下选择15-20个大小相近、直径400-900 μm的健康GBO。用钝化宽口P1000吸头转移，CellBrite染液需新鲜配制并完全覆盖类器官；在37 ℃、5% CO₂、120 r.p.m.条件下孵育30分钟，随后清洗3次并置于冰上，尽快进入植入步骤。
3
建立入位点并固定GB0(约2小时)
将脑片insert转移至培养皿，吸去大部分培养液但避免组织干燥。选择白质区，用微钩轻柔形成足以容纳GBO的浅切口，再以微铲推入类器官。切口应自然回弹包裹GBO；若闭合不充分，可用微钩钝端轻调组织。
4
植入后恢复与共培养
植入后先让脑片恢复2分钟，再缓慢转回培养板；随后10-15分钟内避免移动培养板。37 ℃、5% CO₂静置培养24小时后收集不超过500 μl上清并更换2 ml预温培养基，此后每48小时换液，最长培养10天。
5
设置药物处理与活力监测
药物可从植入后24小时的首次换液开始加入，并在后续换液时维持相应处理。LDH结果反映整个脑片-GBO体系的细胞损伤，不能单独区分宿主脑细胞与肿瘤细胞，因此宜结合荧光面积、组织学和区域化分子读出解释。
6
组织固定与空间分析
用于组织学、Xenium和CODEX的样本可进行甲醛固定及石蜡包埋；计划单细胞分析时可选择速冻。用于LSFEM的样本需完成GBO预标记、固定、通透、可选免疫染色、水凝胶包埋、消化和约1.5倍组织扩增，再进行光片成像及三维重建。
四、常见问题及解决方案
Core2Edge同时涉及新鲜人组织、类器官转移、显微植入和大体积成像，任何一个环节的偏差都可能影响最终结果。
问题一：脑片制备后容易碎裂或培养状态不稳定?
原因分析：初始组织质量不佳，或组织切除后处理延迟；电凝、吸引和水肿也可能损害组织结构。
解决方案：与神经外科团队建立快速交接流程，尽量在切除后2小时内开始处理；切片前评估组织完整性，避免使用碎裂、坏死或明显受损区域。
问题二：GBO在转移或染色过程中受损、荧光过弱?
原因分析：吸头过窄或边缘尖锐、GBO未被染液完全覆盖、染料浓度不合适，或类器官在冰上停留过久。
解决方案：使用钝化宽口吸头，并预先用培养基润滑；选择直径不超过900 μm的GBO；新鲜配制CellBrite染液并确保类器官完全浸没。部分染色已足以辅助植入，不必追求所有细胞均匀强荧光。
问题三：切口撕裂、GBO植入后弹出或转移时脱落?
原因分析：切口过深、操作过于用力、培养液残留过多导致组织移动，或植入后未给予足够稳定时间。
解决方案：保持脑片湿润但不完全浸没，以轻柔浅切口容纳GBO；用微钩钝端调整组织使切口闭合，植入后恢复2分钟，回板后再静置10-15分钟并避免震动。
问题四：LSFEM通透不足、抗体穿透差或背景噪声高?
原因分析：样本较厚、通透时间不足、CHAPS溶液失效或封闭体系与抗体不匹配。
解决方案：使用新鲜CHAPS缓冲液；对较厚样本逐步延长通透和抗体孵育时间，必要时延长至3-4天；封闭血清应与二抗宿主来源匹配，并为扩增后的样本预留足够工作距离。
五、模型鉴定
Core2Edge的鉴定不能只看GBO是否留在脑片中。原文从整体活力、浸润距离、组织整合、三维网络形态和空间细胞状态等多个层面验证模型。
鉴定策略一：生长、活力与组织整合
【鉴定方法】连续活细胞成像量化肿瘤核心直径及“核心+浸润”径向范围；同步检测培养上清LDH，并以H&E、NeuN、GFAP和KP1等组织学/免疫标志物评估脑片结构和GBO整合。
【预期结果与科学解释】在不超过10天的培养窗口内，LDH未显示模型整体细胞毒性增加。GBO逐步扩大并向周围组织浸润。以GBO no. 26为例，核心直径中位数由第2天892 μm增加至第10天1,025 μm；“核心+浸润”径向距离在第10天达到1,465 μm。上述数据来自有限样本，主要用于证明模型具有可量化的生长与浸润行为。
图2 | GBO植入后的整体活力、生长与浸润动态。核心直径变化相对有限，而“核心+浸润”范围随培养时间增加。
鉴定策略二：三维网络与浸润分区
【鉴定方法】对固定样本进行组织扩增和LSFEM成像，依据肿瘤细胞密度划分核心、NIZ与FIZ，并在Imaris中重建肿瘤细胞及TMs，量化区域体积、浸润距离和TM长度。
【预期结果与科学解释】LSFEM可在完整模型中识别从致密核心到单细胞分散区的连续浸润轨迹。个别肿瘤细胞可在距GBO中心最远2,730 μm处检测到；部分TMs向邻近皮质延伸，最长可达750 μm。样本2的TM平均长度为150 ± 117 μm。
图3 | Core2Edge的LSFEM三维成像：GBO核心、NIZ、FIZ及浸润前沿的TM网络。
鉴定策略三：空间细胞状态与微环境
【鉴定方法】使用Xenium进行空间转录组检测，以CODEX开展多重蛋白成像，并结合Seurat注释细胞类型、Neftel框架划分GBM细胞状态，同时比较NIZ与FIZ的内皮和髓系标志物。
【预期结果与科学解释】代表性数据集中，少突胶质细胞占66.3%，免疫细胞占7.7%，内皮细胞及周细胞占7.2%，肿瘤细胞占4.3%。AC-like和MES-like状态主要富集于肿瘤核心，OPC-like和NPC-like状态在浸润前沿更常见；后两类细胞的侵袭评分较高，而前两类细胞的网络连接性相对更强。
图4 | Core2Edge的空间转录组与多重蛋白成像：细胞组成、肿瘤状态分布及NIZ/FIZ微环境。
鉴定策略四：模型适用范围与边界
【模型适用范围】可用于研究GBM浸润、TMs网络、肿瘤-脑微环境互作及不同空间区域的治疗反应；也可作为患者来源GBO的功能测试平台，并减少部分动物实验。
组织来源限制：依赖高质量的新鲜人脑与肿瘤组织，供体差异及取材质量会影响重复性。
异体配对：GBO与脑片通常来自不同供体；因GBO建立需4-6周而脑片仅能短期存活，难以完成自体配对。
培养时间有限：超过约12天后脑片活力和细胞多样性下降，免疫及血管成分尤其容易衰减。
缺少系统循环：模型保留原有血管结构但无灌注，也缺少循环免疫细胞，不能完整模拟免疫募集、血管重塑和肿瘤细胞外渗。
药效证据边界：本论文以方法建立和可行性验证为主，尚不能据此认定Core2Edge已具有临床药敏预测能力。
六、结语
Core2Edge的价值，不在于简单地把GBO放到脑片上，而在于建立一条可操作、可量化的全人源路径，把肿瘤核心、浸润边缘、单细胞分散和宿主脑微环境连接起来。
其重复性依赖几个关键节点：新鲜脑组织的快速处理，直径400-900 μm且无坏死的GBO筛选，白质区的轻柔植入，最长约10天的共培养窗口，以及与研究问题匹配的组织学、三维成像或空间组学终点。
需要强调的是，Core2Edge仍是短期、异体、无灌注的ex vivo模型，不能等同于完整的人体GBM，也不能仅凭本研究推断临床药物反应。未来若能提高组织来源稳定性、引入灌注及循环免疫成分，并在更大规模的患者样本中完成药效和临床结局验证，将更有利于其在机制研究与精准治疗评价中的应用。
参考文献